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Técnicas Servicio de Análisis de Ácidos Nucleicos

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Secuenciación de ADN: Conjunto de técnicas y métodos cuyo objetivo consiste en determinar la estructura primaria del material genético. Es decir, establecer el orden en el que los cuatro nucleótidos que constituyen el ADN –Adenina, Timina, Citosina y Guanina- se encuentran en un fragmento dado.
Los métodos actuales de secuenciación de ADN son una variación del método clásico de terminación de la cadena o método de Sanger, que necesita una hebra molde de ADN de cadena sencilla, un cebador de ADN, una ADN polimerasa con nucleótidos marcados radiactivamente o mediante fluorescencia y nucleótidos modificados (didesoxinucleótidos trifosfato, ddNTPs) que terminan la elongación de la cadena de ADN.
En la actualidad, en nuestro servicio, se desarrolla la conocida como secuenciación por terminador fluorescente, que presenta la mayor de que la secuenciación se puede llevar a cabo en una sola reacción, en lugar de en cuatro reacciones como en el método del cebador marcado.

PCR o reacción en cadena de la polimerasa: Es una técnica cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular. En la teoría, es suficiente con partir de una única copia de un fragmento original o molde para, tras un número N de ciclos, obtener 2N copias de ese fragmento.
La PCR se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. Todo el proceso está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 ciclos con 3 pasos (desnaturalización, unión del cebador y extensión) a diferentes temperaturas. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Éstos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y dNTPs en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores. Previo a estos 20-35 ciclos se da un choque térmico de 94-96 ºC durante 1-4 minutos para desnaturalizar todo el ADN. Posteriormente, suele incluirse una etapa única de elongación final que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74°C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

RT-PCR o PCR cuantitativa: Es una técnica cuyo objetivo consiste en seguir, a tiempo real, la amplificación de un fragmento dado de PCR. Es decir, mediante esta técnica, se amplifica de forma específica, con una PCR, un fragmento de ADN de un gen diana, utilizando en la detección elementos fluoróforos.
Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado y una ADN polimerasa termoestable. A dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos. Dicha medición, se realiza tras cada ciclo de amplificación.
En muchos casos el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es desde el principio ADN, sino que puede ser ADN complementario (ADNc), de hebra simple, obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN); en este caso, la técnica es una RT-PCR cuantitativa o RT-Q-PCR
 

Lectura de Absorbancia, Fluorescencia y Luminiscencia de microplacas de formato flexible: desde placas de 6 a 384 pocillos. Con posibilidad de medidas sobre portaobjetos, placas petri y frascos de cultivo celular. Automatización asequible, con carro con movimiento en los ejes XY, enforque automático, exposición automática y control de la intensidad de LED automática. Con cubos de epifluorescencia optimizados para una sensibilidad superior en fluoróforos comúnmente usados como DAPI, CFP, GFP, YFP, RFP, Texas Rec, CY5 y CY7. El equipo poseé inyector dual de reactivos y cuenta con modalidades de lectura con tecnología patentada Hybrid TechnologyTM, con ópticas de alto desempeño basadas en filtros y ópticas de lata flexibilidad basadas en monocromadores cuádruples

Updated by: Research Central Services

Date: 29 September 2014

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